核酸濃度檢測（二）——讀數解讀及注意事項

當我們(men) 獲得了Micro Drop超微量分光光度計檢測結果後，對光譜的正確分析至關(guan) 重要。

輸出結果的含義(yi) ：

1. A260nm——核酸zui高吸收峰的吸收波長。

2. A280nm——蛋白zui高吸收峰的吸收波長。

3. A230nm——是碳水化合物zui高吸收峰的吸收波長。

4. A340nm——是基線校準波長，為(wei) 檢測溶液樣品的濁度和其他幹擾因子。該值應該接近0.0。如果不是，表明溶液中有懸浮物，需要純化樣品。純樣品的A340一般是0。

●   A230產(chan) 生負值主要是由於(yu) 在很低 DNA 濃度的溶液中的一些其他成分的幹擾所導致的。在下一個(ge) 測定中，需要降低樣品的稀釋度，A230的負值會(hui) 被校正。

●   A260/A280比值可進行核酸樣品純度評估：純DNA的A260/A280比值為(wei) 1.8，純 RNA的A260/A280比值為(wei) 2.0。如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚類物質的汙染，需要純化樣品。

●   A260/A230比值可進行核酸樣品純度評估：純 DNA和RNA的A260/A230比值為(wei) 1.8 – 2.2。若比值小於(yu) 1.8表明樣品被碳水化合物（糖類）、鹽類或有機溶劑汙染，需要純化樣品。當 260/230<1 時，通常隻有兩(liang) 種情況。一是胍鹽汙染，二是蛋白汙染。

樣本的不同提取方法對檢測的影響: 

●   苯酚/ Trizol萃取——殘留試劑汙染可以通過220至240nm之間的異常光譜以及260至280nm區域的偏移來表示。

●   純化柱提取——殘留胍可能有助於(yu) 230nm附近的峰值和從(cong) 230nm到240nm的波穀偏移。

●   磁珠法提取——殘餘(yu) 珠可能會(hui) 導致光散射，並導致異常光譜。

操作注意事項: 

1. A260/A280、A260/A230比值受溶液酸堿度及離子強度的影響，如酸溶液會(hui) 使A260/A280比值降低，低離子強度和低 pH 溶液會(hui) 增加 280 nm 處的光吸收值。因此必須確保空白檢測和溶解樣品所用Buffer的離子濃度和pH值一致。

2. 濃度接近2 ng/μl濃度的樣品可能會(hui) 導致不可靠的260/280和/或260/230的比值。

3. 樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素，由於(yu) 樣品中不可避免存在一些細小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在會(hui) 幹擾測試效果。樣品的濃度不能過低，或者過高（超過光度計的測試範圍）。

4. 樣品混合要充分，否則吸光值太低，甚至出現負值；混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物，否則讀數漂移劇烈。樣品混合不均勻會(hui) 直接導致檢測不確定，重複性低。

5. 樣品檢測上樣量不能太少，必須能夠保證能後連接上下兩(liang) 根光纖形成光柱，從(cong) 而使得檢測正常進行。

6. 樣品台清潔，在檢測前，檢測後以及連續使用儀(yi) 器30分鍾後均需要對上下接觸樣品的部位用雙蒸水或純水擦拭。

7. 切忌不可用噴壺在樣品台上噴射，以防液體(ti) 液體(ti) 進入儀(yi) 器內(nei) 部造成損壞。

8. 切忌不可用洗滌劑或異丙醇清潔基座。

9. 儀(yi) 器放置位置應當遠離通風口，以免液滴蒸發太快導致濃度讀數偏大。