基因擴增PCR的擴增與克隆方法及一些使用的小建議

　基因擴增PCR主要有冰箱、超淨台、加樣器、混勻器、天平等。加樣器、天平除了要外，還應有定期校準。試劑分裝應在超淨台中進行，擴增反應混合液應使用分子生物學級的，試劑製備好後應有質檢：一是否有汙染、二是檢測試劑的擴增效果。

　　基因擴增PCR的擴增與(yu) 克隆方法：

　　①引物的序列應位於(yu) 基因組DNA的高度保守區，且與(yu) 非擴增區無同源序列。這樣可以減少引物與(yu) 基因組的非特異性結合，提高反應的特異性

　　②引物長度：15－40bp為(wei) 宜。引物過短或過長均可使反應的特異性下降。

　　③引物的堿基盡可能隨機發布，避免出現數個(ge) 嘌呤或嘧啶的連續排列，G+C堿基的含量在40%－75%之間。

　　④引物內(nei) 部應避免形成二級結構，特別是引物的末端應避免有回文結構。

　　⑤二個(ge) 引物不應有互補序列，特別是3’端應避免互補，以免形成“引物二聚體(ti) ”，浪費引物。

　　⑥引物5’末端堿基無嚴(yan) 格限製，在與(yu) 模板DNA結合的引物長度足夠的條件下，其5’端堿基可不與(yu) 模板DNA互補而呈遊離狀態，因此可在引物5’端加上限製性內(nei) 切酶位點、啟動子序列或其它序列等以便於(yu) PCR產(chan) 物的分析克隆等，引物的5’端至多可加10個(ge) 堿基而對PCR反應無影響。

　　基因擴增PCR的使用建議：

　　1、使用本製品時務必將Buffer反複混勻後再加，避免因組分不一導致結果差異；

　　2、配置和分裝反應液時請一定使用新的（無汙染的）噴頭以避免汙染；

　　3、如擴增條帶多，可適當添加酶和dNTPs；

　　4、當多重PCR擴增產(chan) 物的長度均在1kb以內(nei) 時，使用3%～4％濃度的Agarosegel進行電泳分離效果。